Zapalenie kości i szpiku (osteomyelitis) rozwija się najczęściej w wyniku zakażenia bakteryjnego. Infekcja bywa wyjątkowo uporczywa i trudna do zwalczenia.
Nawet antybiotyki dobrze penetrujące tkankę kostną nie zawsze osiągają wystarczające stężenie w ognisku zakażenia, zwłaszcza gdy bakterie tworzą biofilm – ochronną, lepką warstwę, która osłania je przed lekami i układem odpornościowym. Dlatego naukowcy zastanawiali się, jak dostarczyć lek bezpośrednio do miejsca, w którym jest najbardziej potrzebny – tak, by zwiększyć lokalną skuteczność jego działania.
Dr hab. inż. Kamila Sadowska, prof. Instytutu Biocybernetyki i Inżynierii Biomedycznej PAN wraz z badaczami z Wydziału Chemii oraz Wydziału Biologii UW, we współpracy z naukowcami z Uniwersytetu Medycznego w Lublinie proponuje odpowiedź na to wyzwanie.
Prof. Kamila Sadowska zaprojektowała tzw. nanokwiaty – mikroskopijne struktury z białka i cynku, zawierające ciprofloksacynę, silny antybiotyk stosowany m.in. w leczeniu zakażeń kości. Jako nośniki do miejscowego podania do ogniska infekcji, uwalniają lek stopniowo i lokalnie, co może zwiększać skuteczność terapii w miejscu zakażenia.
Gdy obrona zawiedzie
W normalnych warunkach nasz układ odpornościowy na co dzień skutecznie kontroluje bakterie naturalnie bytujące na skórze i błonach śluzowych, nie dopuszczając do rozwoju zakażenia.
Zdarza się jednak, że w sprzyjających dla drobnoustrojów okolicznościach – na przykład po urazie, zabiegu operacyjnym lub w przebiegu innej infekcji – przedostają się one głębiej do organizmu i zaczynają się namnażać. Właśnie wtedy może dojść do rozwoju osteomyelitis.
Bakterie mogą dostać się do kości na kilka sposobów. Niekiedy dzieje się to poprzez krew z innego ogniska zakażenia obecnego już w organizmie – w obrębie zębów, skóry czy gardła. Innym mechanizmem są urazy, zwłaszcza złamania otwarte, które otwierają drobnoustrojom drogę do głębszych tkanek. Do zakażenia może dojść również po zabiegach chirurgicznych, choćby po operacyjnym zespoleniu kości lub wszczepieniu implantów ortopedycznych.
Początkowe objawy osteomyelitis łatwo przeoczyć, ale z czasem stają się zwykle bardzo dotkliwe. Pojawiają się gorączka oraz narastający ból, nasilający się nocą i przy ruchu. W bardziej zaawansowanych przypadkach tworzą się przetoki, czyli kanały, którymi wydostaje się treść ropna powstała w wyniku zakażenia. Taki stan najczęściej wymaga już nie tylko antybiotykoterapii, lecz także chirurgicznego oczyszczenia zakażonej tkanki.
Jednym z najpoważniejszych skutków bakteryjnego zapalenia kości jest jej martwica. Może prowadzić do ograniczenia ruchomości, przewlekłego bólu, a nawet złamań wynikających z osłabienia struktury tkanki kostnej.
W najcięższych przypadkach zakażenie może rozprzestrzenić się na cały organizm, prowadząc do sepsy, czyli groźnej reakcji zapalnej obejmującej wiele narządów. Czasem – gdy dochodzi do rozległego zniszczenia tkanek – konieczna bywa amputacja kończyny. Skuteczne leczenie zakażenia kości jest więc sprawą ogromnej wagi.
Bakterie: sprytny przeciwnik
Niestety, infekcja jest groźna, niełatwo ją zwalczyć. Antybiotyki nie zawsze osiągają odpowiednie stężenie dokładnie w miejscu zakażenia. Dzieje się tak na przykład wówczas, gdy bakterie tworzą biofilm – ochronną warstwę utrudniającą dostęp leku – albo gdy infekcji towarzyszą martwicze fragmenty kości. To sprawia, że terapia musi być długotrwała. A im dłużej trwa leczenie, tym większe ryzyko, że u bakterii będzie rosnąć oporność wobec leków.
Bakterie mogą na przykład rozkładać lek chemicznie, zmieniać swoją budowę, by ograniczać jego przenikanie do wnętrza komórki albo błyskawicznie usuwać go na zewnątrz. Mutacje materiału genetycznego lub nabywanie genów od innych gatunków, to kolejne sposoby bakterii na nabycie oporności wobec leków. W efekcie antybiotyk w końcu przestaje działać, a zakażenie rozwija się dalej.
– Nanokwiaty mają na celu zwiększenie skuteczności działania antybiotyku w obecności biofilmu, jednej z najważniejszych barier bakteryjnych. Bakterie bronią się przed lekami, tworząc powłokę z gęstej, lepkiej substancji, pod którą mogą się rozwijać. Jest to rodzaj ich tarczy, jeden z głównych mechanizmów oporu, który naukowcy próbują przełamać. Antybiotyk w wolnej postaci może się bowiem gromadzić na biofilmie, ale ma ograniczoną zdolność jego przenikania – mówi dr Olga Święch z Wydziału Chemii UW.
Podstawowym celem badaczy było więc umożliwienie antybiotykowi działania bezpośrednio w ognisku zakażenia – mimo mechanizmów obronnych bakterii. Takie miejscowe podanie może zwiększać lokalną skuteczność terapii, a jednocześnie potencjalnie zmniejszać ryzyko narastania antybiotykooporności. Podawany doustnie lub dożylnie lek rozprzestrzenia się po całym organizmie, dlatego tylko niewielka jego część dociera do kości. Zastosowanie lokalnych nośników pozwala dostarczyć go w większym stopniu tam, gdzie jest potrzebny.
Jak rosną nanokwiaty?
Zaprojektowane przez dr hab. inż. Kamilę Sadowską nanokwiaty z ciprofloksacyną powstają na zasadzie dość prostej metody chemicznej, czyli tzw. samoorganizacji (self-assembly). Na początku rozpuszcza się białko – w tym przypadku albuminę – w nieznacznie zasadowym buforze PBS (w buforowanej fosforanami soli fizjologicznej o pH 7,4). Następnie do roztworu dodaje się wodny roztwór soli cynku. Jony cynku reagują z fosforanami, tworząc kryształki fosforanu cynku, jednocześnie wiążące się z białkiem. W efekcie całość samoistnie organizuje się w strukturę przypominającą kwiat.
Antybiotyk – ciprofloksacynę – wprowadza się do mieszanki już na etapie przygotowywania roztworu. Dzięki temu zostaje ona „złapana” w powstające kryształki. Gotowe nanokwiaty są następnie odwirowywane, płukane wodą i osuszane. Cały proces zajmuje około czterech godzin, jest więc szybki i wydajny, a przy tym stosunkowo tani.
– Struktura nanokwiatów miała odwzorowywać strukturę kości. Kość jest kompozytem: tak samo jak nanokwiaty, zawiera zarówno element organiczny, czyli białko, jak i nieorganiczny, czyli kryształki hydroksyapatytu wapnia. Chodziło więc o to, aby nie tylko dostarczać lek, lecz także wspomagać regenerację kości po ubytku powstałym po zakażeniu, przez użycie materiału o podobnej budowie, który łatwo będzie integrować się z otoczeniem. Podejmowaliśmy zresztą wcześniej próby z wapniem, otrzymując nanokwiaty zbudowane z albuminy i hydroksyapatytu, ale niestety z bardzo małą wydajnością – mówi prof. Kamila Sadowska.
Zastosowanie cynku ma tę zaletę, że metal ten dużo lepiej wiąże się z białkiem. Jeszcze silniejszą zdolność wykazuje miedź – to właśnie ona była składnikiem pierwszych nanokwiatów opisanych w literaturze naukowej, odkrytych zresztą w warunkach laboratoryjnych przypadkiem. Miedź wykazuje jednak większą toksyczność, dlatego badacze – kierując się względami bezpieczeństwa – postawili na pierwiastek biokompatybilny, czyli niewywołujący niepożądanych reakcji organizmu.
Same korzyści
Nanokwiaty poddano szerokim testom bezpieczeństwa na Uniwersytecie Medycznym w Lublinie. Dr hab. n. med. i n. o zdr. Anna Boguszewska-Czubara sprawdziła, jaki mają wpływ na komórki ludzkie – skóry oraz układu odpornościowego. Ponad 90% z nich przeżywało, co wskazuje na wysoką biokompatybilność materiału w zastosowanych modelach.
Podobnie wykonano badania na erytrocytach, czyli czerwonych krwinkach, aby ocenić, czy nanokwiaty nie uszkadzają ich błon komórkowych. Stopień hemolizy – rozpadu czerwonych krwinek – wynosił mniej niż 5%, a więc również był bardzo niski.
Wreszcie przeprowadzono testy na organizmie żywym – rybkach gatunku Danio rerio. Nanokwiaty nie powodowały ich śmierci ani deformacji. Można więc powiedzieć, że w zastosowanym modelu wykazały wysoki poziom bezpieczeństwa. Co więcej, okazało się, że choć sama ciprofloksacyna w wolnej postaci wykazywała w zastosowanych testach wyższą toksyczność, to dodana w formie zaprojektowanego przez naukowców nośnika – charakteryzowała się lepszym profilem bezpieczeństwa.
To właśnie ograniczenie toksyczności antybiotyku jest jedną z głównych zalet stosowania nanokwiatów. Zwiększenie lokalnej skuteczności działania może w przyszłości pozwolić na ograniczenie obciążenia organizmu terapią, która – mimo że skuteczna – jest na dłuższą metę obciążająca dla organizmu. Choćby dlatego, że człowiek potrzebuje naturalnej flory bakteryjnej – w odpowiednich proporcjach i warunkach.
W równolegle prowadzonych badaniach na Wydziale Biologii UW, dr Piotr Golec wykazał, że nanokwiaty efektywnie zwalczają trzy rodzaje bakterii: Staphylococcus aureus (gronkowiec złocisty), Pseudomonas aeruginosa (pałeczka ropy błękitnej) oraz Klebsiella pneumoniae (pałeczka zapalenia płuc). Zastosowanie nośnika leku nie ograniczyło działania antybiotyku. Nanokwiaty z ciprofloksacyną wykazywały wyraźne działanie bakteriobójcze, porównywalne lub nawet silniejsze niż wolny lek.
Efekt badań zadowala, jednak naukowcy nadal poszukują kolejnych ulepszeń.
– Choć wydajność reakcji jest już dobra, to można jeszcze sporo w tej materii zrobić. Obecnie prowadzimy badania z użyciem innych białek oraz jonów metali oraz planujemy dalsze badania in vivo – dodaje prof. Sadowska.
