Białka i ich zespoły można porównać do mikroskopijnych maszyn pracujących w naszych komórkach. Żeby działały prawidłowo, muszą przyjąć odpowiedni kształt – zwijać się i rozwijać w ściśle określony sposób. Kiedy proces ten zostaje zaburzony, mogą pojawiać się choroby. Problem w tym, że takie zmiany zachodzą w skali rzędu ułamków nanometra, czyli mniejszej niż miliardowa część metra, dlatego niezwykle trudno je bezpośrednio obserwować.
Jak zobaczyć coś, czego nie widać?
To samo białko może zachowywać się inaczej w zależności od środowiska, w którym się znajduje – na przykład zależnie od pH, stężenia soli czy obecności innych cząsteczek.
W jednych warunkach będzie bardziej zwinięte i stabilne, w innych łatwiej zmieni swoją strukturę. To z kolei wpływa na to, jak oddziałuje z innymi białkami, lekami czy komórkami.
Od końca lat 90. naukowcy potrafią obserwować rozwijanie i zwijanie pojedynczych cząsteczek białek, ale zespół z UW chce zobaczyć znacznie więcej – także subtelne stany pośrednie pojawiające się w trakcie tych zmian.
– Nasze podejście polega na tym, żeby nie próbować bezpośrednio „zobaczyć” struktury białka, ale wnioskować o niej na podstawie właściwości mechanicznych. Mierzymy lokalną sztywność i tzw. tarcie wewnętrzne cząsteczki. Ten drugi parametr mówi o szybkości strat energii przez daną strukturę chemiczną. Te parametry zmieniają się wraz ze zmianą struktury, więc mogą powiedzieć nam coś o jej stanie, także o stanach pośrednich w trakcie fałdowania – wyjaśnia prof. dr hab. Robert Szoszkiewicz z Laboratorium Fizykochemii Materiałów Centrum Nauk Biologiczno-Chemicznych Uniwersytetu Warszawskiego.
Każda zmiana w strukturze, nawet bardzo niewielka, wpływa na to jak bardzo białko jest podatne na rozciąganie i ile energii traci podczas ruchu. Trochę przypomina to strunę instrumentu: nie widzimy jej wnętrza, ale po dźwięku potrafimy rozpoznać, jak mocno jest napięta.
Pojedyncza cząsteczka pod mikroskopem
Kluczowym narzędziem w tych badaniach jest mikroskop sił atomowych (AFM). Jego działanie można porównać do gramofonu – z tą różnicą, że zamiast odczytywać zapis dźwięku z płyty, pozwala badać właściwości pojedynczych cząsteczek. W mikroskopie AFM bardzo cienka końcówka, zakończona igłą o rozmiarach rzędu kilku atomów, „dotyka” próbki i reaguje na jej właściwości. W klasycznym trybie pozwala to obrazować powierzchnię, jednak w badaniach nad białkami wykorzystuje się inną metodę, tzw. spektroskopię sił. W tym przypadku cząsteczki białka są przyczepiane do podłoża, a końcówka mikroskopu próbuje uchwycić ich drugi koniec i stopniowo je rozciągać.
– Możemy na przykład przyłożyć fizjologicznie relewantną siłę (taką, na którą reagują białka – przyp. red.) rzędu 100 pikoniutonów (pikoniuton to jedna bilionowa część niutona – jednostki siły – przyp. red) i obserwować, jak białko się rozwija, a następnie stopniowo ją zmniejszać i śledzić proces jego ponownego zwijania. Najciekawsze dzieje się właśnie „po drodze”, kiedy śledzimy zmiany tych parametrów – tłumaczy prof. Szoszkiewicz.
Żeby mieć pewność, że rzeczywiście obserwują zachowanie konkretnego białka, badacze często łączą wiele jego identycznych kopii w dłuższy łańcuch. Dzięki temu podczas eksperymentu te same sygnały powtarzają się wielokrotnie, co ułatwia odróżnienie prawdziwego pomiaru od przypadkowych zakłóceń.
– Kluczowe jest to, że możemy kontrolować bardzo małe siły działające na białko i obserwować, jak reaguje ono w różnych warunkach fizykochemicznych, na przykład w różnych roztworach. To daje nam dostęp do informacji, które wcześniej były praktycznie nieosiągalne – dodaje naukowiec.
Różnym konfiguracjom przestrzennym odpowiadają odmienne właściwości mechaniczne cząsteczki – różne kształty białka sprawiają, że inaczej zachowuje się ono podczas rozciągania i ruchu.
Co ważne, aparatura używana w tych badaniach została zbudowana przez zespół z UW.
Drgania, które mówią więcej niż obraz
Najbardziej oryginalnym elementem metody jest sposób pomiaru tych parametrów. Końcówka mikroskopu AFM nie jest jedynie „czujnikiem”, ale zachowuje się jak drgająca belka o określonych częstotliwościach rezonansowych, czyli częstotliwościach, przy których belka drga z największymi wychyleniami (amplitudami).
– Każdy układ drgający ma takie częstotliwości, przy których drga najłatwiej. My śledzimy kilka z nich jednocześnie i patrzymy, jak zmieniają się w trakcie eksperymentu – wyjaśnia prof. Szoszkiewicz.
Kiedy końcówka mikroskopu połączona jest z białkiem, nawet bardzo drobne zmiany w jego strukturze wpływają na sposób, w jaki drga belka AFM-u. Przesunięcia częstotliwości rezonansowych stają się czułym wskaźnikiem zmian zachodzących w cząsteczce. Dzięki temu naukowcy mogą odczytać, czy białko właśnie się rozwija, zwija albo przechodzi do innego ułożenia swoich fragmentów.
– To może wydawać się zaskakujące, bo mamy do czynienia ze sporym elementem, belką mikroskopu o długości mierzonej w dziesiątkach mikrometrów, połączonym z bardzo małym obiektem, jakim jest białko, o średnicy mierzonej w nanometrach. A jednak wpływ białka na drgania belki jest mierzalny – zaznacza badacz.
Uzyskane w ten sposób dane nie pozwalają jeszcze bezpośrednio „zobaczyć” struktury białka, ale stanowią podstawę do dalszych analiz. Kolejnym krokiem jest połączenie wyników eksperymentalnych z symulacjami komputerowymi.
– Różne konfiguracje białka mają różną sztywność i różne tarcie wewnętrzne. Jeśli połączymy nasze pomiary z symulacjami dynamiki molekularnej, możemy zacząć wnioskować, jakie konfiguracje są najbardziej prawdopodobne – tłumaczy.
Co udało się zaobserwować?
Naukowcom udało się stworzyć model, który pozwala odczytywać z pomiarów mikroskopu, jak sztywne jest białko i ile energii traci podczas zmiany swojej struktury.
Żeby było to możliwe, musieli bardzo dokładnie opisać zachowanie samej końcówki mikroskopu AFM, która podczas eksperymentu nieustannie drga – także w środowisku takim jak woda.
Badania pokazały, że właściwości białka potrafią zmieniać się bardzo dynamicznie. W szczególności, kiedy białko jest rozciągnięte, staje się też wyraźnie sztywniejsze, i traci więcej energii podczas zmian swojej struktury.
Dla jednego z modelowych białek, udało się również uchwycić krótkotrwałe stany pośrednie, pojawiające się między formą zwiniętą a rozwiniętą. To ważne, bo właśnie w takich momentach białko może zmieniać swoją strukturę w sposób wpływający na jego późniejsze działanie. Do tej pory te przejściowe etapy były bardzo trudne do zaobserwowania.
Istotny wniosek: kluczowa rola środowiska
Jednym z najciekawszych rezultatów jest to, że obserwowane tarcie nie wynika wyłącznie z samej struktury białka. W dużej mierze zależy ono od oddziaływań białka z otoczeniem, przede wszystkim z wodą.
To oznacza, że proces fałdowania nie jest wyłącznie „wewnętrzną sprawą” cząsteczki, ale w istotny sposób zależy od środowiska, w którym zachodzi. Szczególnie ważne jest to, że tarcie wewnętrzne można powiązać z procesami zachodzącymi na poziomie molekularnym, np. zmianami w układzie wiązań wodorowych w środowiskach wodnych lub reorganizacją struktury białka.
Opracowana metoda pozwala badać białka w sposób, który dotychczas był praktycznie niedostępny: na poziomie pojedynczej cząsteczki, w trakcie rzeczywistego procesu, z uwzględnieniem bardzo drobnych zmian strukturalnych.
Krok w stronę nowych zastosowań
Choć są to badania podstawowe, czyli nastawione przede wszystkim na zrozumienie, jak zachowują się białka, w przyszłości mogą pomóc także w medycynie, szczególnie w obszarze nowotworowych terapii celowanych.
W nowoczesnych strategiach leczenia nowotworów coraz częściej wykorzystuje się krótkie fragmenty białek, tzw. peptydy, które działają jak „klucz” dopasowany do konkretnego „zamka” – mają rozpoznawać konkretne komórki nowotworowe, i precyzyjnie do nich trafiać.
Problem w tym, że wewnątrz guza panują inne warunki niż w laboratoryjnych eksperymentach. To sprawia, że takie cząsteczki mogą zmieniać swój kształt i działać inaczej, niż zakładali projektujący je naukowcy.
– Zmienia się pH, stężenie jonów, obecność różnych cząsteczek. To sprawia, że peptydy mogą przyjmować inną strukturę niż zakładana i przestają działać tak, jak powinny – wyjaśnia prof. Szoszkiewicz.
Jednym z możliwych rozwiązań jest dokładniejsze poznanie tego, jak konkretne cząsteczki zachowują się w różnych środowiskach. Właśnie tutaj swoją rolę mogą odegrać metody rozwijane na Uniwersytecie Warszawskim.
– Możemy badać, jak zmieniają się właściwości mechaniczne peptydów w różnych warunkach, a następnie, w połączeniu z symulacjami komputerowymi, próbować odtworzyć ich najbardziej prawdopodobne struktury. To może pomóc wskazać, które z nich będą działały najlepiej w konkretnym środowisku – tłumaczy badacz.
Jednocześnie metoda ma swoje ograniczenia. Najlepiej sprawdza się w przypadku małych białek i peptydów. W przypadku większych struktur różne konfiguracje mogą dawać podobne wartości mierzonych parametrów, co utrudnia jednoznaczną interpretację wyników. Drugim wyzwaniem jest rozdzielczość czasowa pomiarów. Procesy fałdowania białek mogą zachodzić bardzo szybko.
– Oznacza to, że nie zawsze jesteśmy w stanie uchwycić wszystkie krótkotrwałe stany pośrednie. Ale z punktu widzenia zastosowań często ważniejsze są bardziej stabilne struktury końcowe i te jesteśmy w stanie badać – mówi prof. Szoszkiewicz.
Mimo ograniczeń podejście pozostaje unikatowe i rozwijane jest tylko w kilku ośrodkach na świecie!
– To trudna metoda, wymagająca czasu i zasobów. Ale właśnie takie podejścia czasem prowadzą do najbardziej interesujących rezultatów – podkreśla naukowiec.
Co dalej?
Obecna metoda pozwala obserwować zmiany zachodzące w białkach z dokładnością do ułamków sekundy. To dużo, ale część procesów przebiega jeszcze szybciej – na przykład chwilowe zrywanie i tworzenie nowych wiązań chemicznych, które pomagają białku zmieniać kształt.
Kolejnym krokiem będzie więc zwiększenie tej rozdzielczości oraz dalsze rozwijanie modeli, które pozwolą jeszcze dokładniej powiązać właściwości mechaniczne z konkretnymi zmianami w organizacji cząsteczki. Celem jest pełne odtworzenie przebiegu fałdowania, krok po kroku, na poziomie pojedynczej cząsteczki.
Naukowcy chcą zwiększyć szybkość pomiarów, żeby móc śledzić cały proces zwijania białka niemal klatka po klatce, jak bardzo dokładne nagranie w zwolnionym tempie.
– To projekt wymagający czasu, zespołu i finansowania. Bez odpowiednich zasobów trudno go przyspieszyć. W przyszłości kluczowa będzie także współpraca z naukami medycznymi, jeśli metoda ma znaleźć zastosowania terapeutyczne – mówi prof. Szoszkiewicz i podkreśla, że mimo trudności warto podejmować takie wyzwania: – W nauce często najbardziej wymagające problemy okazują się ostatecznie najciekawsze.
